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点击次数：2153 发布时间：2018/12/14 19:39:22
今日喆图小编教大家如何提取质粒DNA的实验；实验所用设备：恒温培养箱、恒温水浴锅、真空干燥箱。
实验方法原理
碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
实验材料
大肠杆菌
试剂、试剂盒 Tris-HclEDTA葡萄糖NaOHKAacNaAc异丙醇溶菌酶酚:氯仿无水乙醇LB培养基
仪器、耗材 超净工作台、恒温培养箱、摇床、恒温水浴锅、台式离心机取液器、低温冰箱冷冻、真空干燥机、电泳仪水平电泳槽、紫外观测仪
实验步骤 一、材料与试剂准备
1. 材料：大肠杆菌。
2. 仪器：超净工作台，恒温培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。
3. 试剂：（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。（4）3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，
4℃保存。（5）异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。
二、操作步骤
1. 细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，摇一摇，过夜。
2. 离心10 min，5 000 rpm， 4℃；弃上淸液。
3. 沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。
4. 重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。
5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。
6. 加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4℃。
7. 加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min。
8. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。
9. 取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。
10. 加入40 ul，3 M NaAc。
11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。
12. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。
13. 取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
14. 电泳检测提取DNA的质量。
有关设备：恒温培养箱、恒温水浴锅、真空干燥箱，详情可咨询上海喆图。
原创作者：上海喆图科学仪器有限公司
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